| Titre : | Recherche dans des écosystèmes extrêmes de nouvelles souches d’Actinomycètes productrices de substances antimicrobiennes : Caractérisation des molécules bioactives |
| Auteurs : | Belgacem Habiba, Auteur ; Benreguieg Mokhtar, Directeur de thèse |
| Type de document : | texte imprimé |
| Editeur : | [S.l.] : [S.l.] : Dr. Moulay Tahar Université Saida, Faculté des Sciences Naturelles et de la Vie, 2022/2023 |
| Format : | 127 p / 29 CM |
| Accompagnement : | CD |
| Langues: | Français |
| Langues originales: | Français |
| Catégories : | |
| Mots-clés: | Actinomycètes ; composés bioactifs ; GC-MS ; Activité antimicrobienne.Isolat TR10 |
| Résumé : |
Cette étude s'intéresse d'une part à la recherche et à l’isolement à partir de différents biotopes
naturels des souches d’Actinomycètes éventuellement productrices de substances antimicrobiennes et d'autre part à l’étude de ses propriétés antagonistes et à la caractérisation des molécules bioactives sécrétés. Quatre-vingt-dix (90) isolats d’actinomycètes sont obtenus à partir de cinq échantillons de sol, provenant de différentes régions arides et semi arides d’Algérie. Le screening primaire des activités antimicrobiennes en utilisant la technique de cylindres d’agar a montré la présence d’une activité antibactérienne et/ou antifongique chez Soixante-dix-neuf (79) souches parmi les 90 souches isolées. L’isolat codée TR10 isolée de la rhizosphère du sol d'acacia de Tamanrasset, dans le sud de l'Algérie a été sélectionnés pour leurs propriétés antagonistes importantes vis-à-vis de 19 germes cibles. Cet actinomycète rhizosphérique a été caractérisé et soumis à des tests biochimiques ainsi à une fermentation sur milieu liquide et à l'extraction par le solvant d'acétate d'éthyle .Son extrait brut a été examiné pour son activité antimicrobienne en utilisant la gélose Mueller-Hinton (MHA). Les meilleures zones d'inhibition (ZI) détectées contre des organismes cibles Escherichia coli ATCC 25922 (40mm), Staphylococcus aureus ATCC 25923 (40mm), Staphylococcus aureus (MRSA) ATCC 33591 (18mm). La levure Candida albicans ATCC 10231 (20mm) et les champignons phytopathogènes Penicilluim sp (20mm) .La cinétique de production des antibiotiques révèle que la production maximale est au 6 et 7 ème jour d’incubation. Les valeurs des concentrations minimales inhibitrices ont été déterminées en utilisant la méthode des dilutions sur les microplaques. Quinze composés de l'extrait méthanolique ont été identifiés à l'aide de la GC-MS (chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse). Les principales substances trouvées sont phénol (33,23%), Cyclohexanone, 5- méthyl-2-(1-méthyléthylidène)- (9,95%), 1,6-Octadien- 3-ol, 3,7-diméthyl-, formate (20,24%). La taxonomie moléculaire et les analyses phylogénétiques est avéré que la souche TR10 c'est une nouvelle souche qui appartient au genre Streptomyces. L'analyse du séquençage des nucléotides de l'ADNr 16S de l'isolat a été rapportée à GenBank avec le code d'accès OP617665. Les résultats de cette étude montrent la présence de divers composés bioactifs dans la rhizosphère du sol d'acacia de Tamanrasset. Dans l'ensemble les micro-organismes découverts dans les écosystèmes extrêmes Algériens inexplorés étaient une source prometteuse pour le développement de nouveaux antibiotiques. |
| Note de contenu : |
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INTRODUCTION ................................................................. Erreur ! Signet non défini. ChapitreI : Revue Bibliographique ................................................................................... 4 I. Les Actinobactéries ................................................................................................... 4 1. Historique .............................................................................................................. 4 2. Définition des actinobactéries ............................................................................... 4 3. Caractéristique générale d'actinobactéries ............................................................ 5 4. Ecologie des actinobactéries et leur distribution dans la nature ........................... 9 4.1. Environnement terrestre .................................................................................................... 11 4.1.1. Actinomycètes de la rhizosphère .................................................................................... 11 4.2. Eaux douces et marines ...................................................................................................... 12 4.3. Air ....................................................................................................................................... 12 4.4. Composts ............................................................................................................................ 12 4.5. Végétaux, animaux et homme ........................................................................................... 12 5. Taxonomie et critères d’identification ................................................................... 14 5.1. Taxonomie phénotypique................................................................................. 15 5.1.1. Critères morphologiques ................................................................................................. 15 5.1.2. Critères chimiques (chimiotaxonomique) ....................................................................... 16 5.1.2.1. Acides aminés pariétaux........................................................................................... 16 5.1.2.2 Sucres cellulaires ........................................................................................................... 17 5.1.2.3. Lipide ........................................................................................................................ 17 5.2.1.3. Critères physiologiques et taxonomie numérique ....................................................... 185.2.2. Taxonomie moléculaire ................................................................................ 18 5.2.2.1. Séquençage de l'ADN ribosomique 16S ............................................................ 19 5.2.2.2. Hybridation ADN-ADN .................................................................................................. 19 5.2.2.3. Pourcentage de guanine-cytosine (G+C) ...................................................................... 20 6. Cycle de développement des actinobactéries ...................................................... 22 7. Métabolites secondaires des actinomycètes ............................................................ 22 7.1. Antibiotiques .................................................................................................... 23 7.2. Pesticides biologiques ...................................................................................... 24 7.3. Hormones de croissance végétale .................................................................... 24 7.4. Substances anti-tumorales ................................................................................ 24 7.5. Agents antiviraux ............................................................................................. 25 7.6. Composés pharmacologiques........................................................................... 26 7.8. Pigments ........................................................................................................... 26 7.8. Enzymes commerciales .................................................................................... 28 7.9. Inhibiteurs enzymatiques ................................................................................. 30 7.10. Composés anti-inflammatoires ...................................................................... 31 7.11. Aliments protéiques unicellulaires ................................................................. 31 7.12. Biosurfactant .................................................................................................. 31 7.13. Bioherbicides ................................................................................................. 32 7.14. Biodégradation des polluants ......................................................................... 32 7.15. Effet de biosorption........................................................................................ 33 Chapitre II: Matériels et méthodes .................................................................................. 34 I. Origine des échantillons et isolement des actinobactéries. ...................................... 34 1. Les échantillons de sols ...................................................................................... 34 2. Echantillonnage................................................................................................... 35 3. Mesure de pH des échantillons ........................................................................... 35 4. Isolement des actinobactéries ..................................................................................... 36 4.1. Prétraitement des échantillons de sols .............................................................................. 36 A / le Séchage ........................................................................................................................ 36 B / Enrichissement de l'échantillon en bicarbonate de calcium(CaCO3) .............................. 36 4.2. Les milieux de cultures utilisés ........................................................................................... 36 4.3. Préparation de la suspension-dilution et ensemencement ............................................... 36 4.3.1. Ensemencement en masse .......................................................................................... 37 4.3.2. Ensemencement en surface ........................................................................................ 37 5. Reconnaissance des actinobactéries ................................................................... 376. Dénombrement et Sélection des Actinomycètes ................................................. 37 7. Purification et conservation des actinobactéries ................................................. 37 II. Criblage de l’activité antimicrobienne des actinobacteries .................................... 38 1. Microorganismes-cibles ...................................................................................... 38 2. Tests d’antagonismes (étude de l’activité antagoniste invitro) ........................... 40 2.1. Etude de l’activité antibactérienne .................................................................................... 40 2.1.1. Méthode des cylindres d’agar ......................................................................................... 40 2.2. Etude de l’activité antifongique ......................................................................................... 40 2.2.1. Préparation des suspensions fongiques ...................................................................... 40 2.2.2. Mise en évidence des activités antifongiques ............................................................. 40 2.3. Lecture ............................................................................................................................ 41 3. Choix des meilleurs isolats d’actinobactéries antagonistes ................................ 41 III. Etude de l’activité antibiotique de la souche sélectionnée.................................... 41 1. Cinétiques de production des antibiotiques en milieu liquide ............................ 41 2. Préparation de pré-culture ................................................................................... 41 2.1. Ensemencement en fioles agitées ...................................................................................... 41 2.2. Cinétique de production de la substance antimicrobienne ............................................... 41 2.3. Extraction de la substance antimicrobienne (filtrat deculture) ......................................... 42 2.4. Choix du solvant d'extraction optimal................................................................................ 43 3. Révélation microbiologique de la substance antimicrobienne « bio- autographie» ..................................................................................................................... 43 4. Séparation de l’extrait brut sur chromatographie couche mince(CCM). ............ 44 4.1. La semi-purification des fractions séparées par CCM : ...................................................... 44 4.2. Contrôle de l’activité de chaque composant séparé : ........................................................ 45 5. Détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) du métabolite ......................................................................................................................... 45 6. Identification des composés bioactifs par chromatographie en phase gazeuse- spectrométrie de masse (GC/MS) : ................................................................. 45 VI. Caractérisation des isolats.................................................................................... 46 1. Etude des caractères morphologiques ............................................................... 46 1.1. Aspect microscopique ....................................................................................................... 46 1.2. Aspect macroscopique ....................................................................................................... 46 1.3. Production de pigments mélanoïdes.................................................................................. 46 2. Etudes des caractères biochimiques .................................................................... 46 2.1. Hydrolyse de l’amidon ........................................................................................................ 47 2.2. Hydrolyse de la caséine ...................................................................................................... 472.3. Hydrolyse de la gélatine (Test gélatinase).......................................................................... 47 2.4. Dégradation de l’urée......................................................................................................... 47 2.5. Action sur le lait écrémé ..................................................................................................... 47 2.6. Recherche sur le nitrate réductase .................................................................................... 47 2.7. Recherche de la production d'indole ................................................................................. 48 2.8. Recherche de l’enzyme catalase ........................................................................................ 48 2.9. Etude de la mobilité et de la dégradation du mannitol ..................................................... 48 2.10. L’utilisation des différents substrats carbonés/Production de H2S.................................. 48 2.11. L’utilisation de citrate comme seule source de carbone ................................................. 49 3. Des caractères physiologiques ............................................................................ 49 3.1. Croissance en présence de différentes concentrations de chlorure de sodium ............... 49 3.2. Croissance à différents pH .................................................................................................. 49 3.3. Croissance à différentes températures .............................................................................. 49 4. Caractérisation moléculaire ................................................................................ 50 4.1. Extraction de l'ADN génomique, amplification, purification et séquençage du gène de l'ARNr 16S .................................................................................................................................. 50 Chapitre III : résultats et discussion ................................................................................ 52 I. Caractéristiques des échantillons et isolement des actinobactéries ............................. 52 1. PH des échantillons .................................................................................................... 52 2. Résultats d’isolement des actinobactéries des sols arides et semi arides .............. 52 II. Criblage de l’activité antimicrobienne des actinobacteries .................................... 57 1. Résultats de l’action antagoniste des isolats d’actinobactéries ........................... 57 1.1. Résultats de l’activité antibactérienne des isolats ............................................................. 57 1.2. Résultats de l’activité antifongique des isolats : ................................................................ 60 2. Résultat de choix de meilleur isolat d’actinobactérie antagoniste ...................... 64 III. Résultat d’étude de l’activité antibiotique de la souche sélectionnée «TR10» ................................................................................................................................. 64 1. Résultat de la cinétique de croissance et production de la substance antimicrobienne ................................................................................................................ 66 2. Résultat de choix du solvant d'extraction optimal .............................................. 70 3. Révélation microbiologique de la substance antimicrobienne « bio- autographie » .................................................................................................................... 71 4. Séparation de l’extrait brut sur chromatographie couche mince(CCM). ........... 71 4.1. La semi-purification des fractions séparées par CCM ........................................................ 73 4.2. Contrôle de l’activité de chaque composant séparé : ........................................................ 73 5. Détermination des concentrations minimales inhibitrices (CMI) : ..................... 756. Identification des composés bioactifs par chromatographie en phase gazeuse- spectrométrie de masse (GC/MS) : ................................................................. 76 IV. Caractérisation des isolats.................................................................................... 81 1. Etude des caractères morphologiques ............................................................... 81 1.1. Aspect microscopique ........................................................................................................ 81 1.1.1. Coloration de Gram ..................................................................................................... 81 1.2. Aspect macroscopique ....................................................................................................... 82 1.2.1. Isolation et identification de TR10 .................................................................................. 82 2. Le séquençage du gène de l'ARNr 16S ............................................................... 83 Conclusion et Perspectives ............................................................................................. 87 Références bibliographiques ........................................................................................... 91 Annexe 1 .................................................................................................................................. 119 Annexe 2 ................................................................................................................................. 123 Publication .................................................................................................................... 127 |
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